УДК: 612.821.44/822

1. Введение

В системной организации поведенческих актов подкрепление, как известно, завершает динамическую архитектонику центральных узловых механизмов, направленных на удовлетворение ведущей потребности организма (Анохин П.К., 1974). Функциональный отрезок физиологических процессов от потребности к ее удовлетворению обозначен нами как системный Lквант поведения¦ (Судаков К.В., 1992).

В системных Lквантах поведения¦ подкрепление наряду с удовлетворением исходных потребностей для организма является своеобразным вознаграждением, поскольку, как правило, сопровождается положительной эмоцией. Процесс подкрепления, в свою очередь, включает две фазы: сенсорное и метаболическое насыщение (Анохин П.К., Судаков К.В., 1971). Именно сенсорное, оно же первичное или чувственное насыщение, обусловленное действием подкрепляющих факторов на соответствующие рецепторы организма, сопровождается положительной эмоцией и позволяет субъектам быстро оценивать удовлетворение потребностей и реализовывать их в сравнительно короткие отрезки времени. Показано, что в механизмах сенсорного насыщения участвуют биологически активные олигопептиды. В частности, в организации пищевого сенсорного насыщения установлена роль холецистокинина (Анохин К.В., 1990). В сенсорных механизмах удовлетворения жажды принимает участие ангиотензин-II (Olds, 1991). Половое удовлетворение связывают с действием некоторых фрагментов пролактина и адрено-кортикотронный гормон (АКТГ). Наши исследования показали, что при электрическом раздражении мотивациогенных центров гипоталамуса у животных, ранее удовлетворявших возникшую при этом потребность, наблюдаемые поведенческие эффекты зависят от синтеза в структурах мозга специфических белковых молекул. Поведение, вызванное стимуляцией гипоталамуса, подавляется на фоне действия блокаторов синтеза белка и восстанавливается при интрацеребровентрикулярном введении олигопептидов (Судаков К.В., 1991). На основании этих экспериментов мы предположили, что эйфоригенные лиганды образуются в мозгу при любых формах подкрепления. Они должны экспрессироваться, в частности, и при приеме этанола и наркотических веществ как подкрепляющих факторов. Подтверждением данного предположения являются наблюдения (Blum et al, 1986; Lithin, Tabakoff, 1989; Mucha et al, 1992), показавшие, что эйфоризирующее действие этанола связано с активацией опиатной системы мозга и повышением содержания в спинномозговой жидкости морфиноподобных соединений. Л.В.Тимофеева с соавт. (1991) продемонстрировали, что алкогольная мотивация у животных подавляется после введения блокатора синтеза белка циклогексимида. Все это указывает на участие белковоподобных факторов в механизмах подкрепления и делает реальным выделение белковых факторов эйфории из мозга.

В связи с этим цель настоящего исследования заключалась:

а) в выделении из ткани мозга мини-свиней после приема ими этанола биологически активных эйфоригенных фракций;

б) в идентификации наличия аналогичных эйфоригенных фракций в нативном мозгу быков;

в) в очистке, тестировании и секвенировании эйфоригенного фактора, находящегося в ткани мозга.

Полученные в процессе выделения фракции мозга анализировали с помощью биологического тестирования. От каждой фракции отбирали аликвотные количества (обычно 25 или 50% от всего полученного материала по фракциям), которые лиофильно высушивали и хранили в низкотемпературном холодильнике (-18-20^оС) до использования в экспериментах. Осуществляли, как правило, двойное, а в некоторых случаях - тройное слепое тестирование физиологических эффектов фракций.

Тестирование осуществляли на крысах. Опыты проводили на беспородных крысах-самцах, весом 180-200 г, в возрасте 4-6 недель, стандартизированных по состоянию здоровья. Исследования проводили в одно и то же время суток при стандартной освещенности.Выделенные из мозга фракции вводили в боковые желудочки мозга крыс через предварительно вживленные канюли. Диаметр канюль равнялся 0,840 мм, длина - 8 мм. Объем вводимых растворов фракций составлял 3 мкл. Растворы готовили в стерильной дистиллированной воде или апирогенном физиологическом растворе. В большинстве экспериментов применяли инстилляции растворов фракций мозга на конъюктиву глаз по 5 мкл аликвотных доз фракций эндогенных факторов. В качестве контроля использовали инъекции или инстилляции стерильной дистиллированной воды, апирогенного физиологического раствора, 10%- и 15%-ного раствора этанола, 100 нг/3 мкл b-эндорфина, лей-энкефалина, ангиотензина-II и некоторых других физиологически активных пептидов, обладающих положительным подкрепляющим действием, а также психостимуляторов и наркотиков. Положительную подкрепляющую активность перечисленных в табл. 1 веществ определяли по временным параметрам поведения крыс в тесте LPlace Preference¦. Результаты исследований подвергали статистическому анализу с использованием общепринятых программ на РС АТ.

Эксперименты проведены на 2396 крысах. Физиологическую активность полученных фракций мозга оценивали у крыс по характеру их поведения в тесте LPlace Рreference¦ в экспериментальной камере. Анализировали время пребывания крыс в различных отсеках камеры и общий репертуар поведения. Конструкция камеры была нами несколько модернизирована. Камера имела три отсека: стартовый отсек (С), отсек с решетчатым металлическим полом (РП) и отсек с гладким полом из оргстекла (ГП). В отдельных экспериментах на решетчатый пол в отсеке РП, при заходе в него крыс, подавали электрический ток. Интенсивность тока изменяли от пороговых до сверхпороговых значений в момент пребывания крысы в этом отсеке. В экспериментах использовали ток от 0,3 до 1,5 мA, который подбирали индивидуально для каждого животного. В результате электрического раздражения крысы избегали посещать отсек РП. Крыс помещали в отсек С и в течение 20 минут регистрировали их поведение и время пребывания в каждом отсеке камеры. Наблюдения одновременно вели за тремя крысами, находящимися в отдельных идентичных камерах. В течение 4-5 экспериментальных дней у крыс регистрировали фоновую поведенческую активность. После фоновых измерений животным посредством микрошприца вводили растворы фракций. Введение фракций проводили однократно в непредпочитаемом животными отсеке камеры. Общий репертуар поведения крыс за 20 минут пребывания в экспериментальной камере оценивали по соотношению временных характеристик ориентировочно-иссле-довательского (ОИП), комфортного (КП), пассивно-оборонительного (ПОП) и других форм (ДФП) поведения.

Таблица 1

Примечание: n 576 (n = 18 - количество крыс для каждого исследованного вещества)

3.1. Эффекты эйфоригенных фракций мини-свиней

В 62 экспериментах исследовано 62 фракции, полученные из мозга мини-свиней с молекулярной массой от 200 до 25000 Д. Фракции имели маркировки S 1-23; DV 1-39. Последовательно воспроизводимое фракционирование гомогената мозга и определение физиологической активности полученых эндогенных соединений позволило из 62 выделить 5 фракций, обладающих высоким положительным подкрепляющим действием (табл. 1). Наиболее выраженные подкрепляющие свойства были отмечены у фракций: S-8, S-13, -21, DV-18, DV-20. Однократная инстилляция аликвотных доз каждой из этих фракций на конъюктиву приводила у 73,3% крыс (44 из 60 животных), исследованных с указанными фракциями) к достоверному (Р<0,05) изменению места предпочтения в экспериментальной камере. Во всех указанных случаях крысы предпочитали находится в ранее непредпочитаемом отсеке установки, где им производили аппликацию исследуемой фракции (рис. 1). Эффект продолжался не менее 2-х недель наблюдения. В некоторых случаях   - до 3-х месяцев. Более длительного наблюдения не производили. Наиболее выраженное действие указанных фракций на крыс наблюдалось на 1-3 сутки после введения. Затем время пребывания животных в непредпочитаемом отсеке экспоненциально снижалось до исходного фонового уровня.

В первые 15-20 минут после аппликаций эйфоригенных фракций (например DV-18) в поведении животных отмечено возникновение реакции замирания с последующим переходом к игровому поведению. Наиболее характерными формами поведения крыс при этом были различные виды комфортного поведения, груминг, сексуальные реакции и др. Специфически характерным было появление на 10-15 минуте после аппликации на конъюктиву фракций отдельных форм игрового поведения, в частности, игры с хвостом. У некоторых крыс в эти сроки наблюдалось сонливое состояние, переходящее в отдельных случаях в сон. Спектр репертуара поведения животных возвращался к фоновому уровню через 10-15 суток после введения фракций.

Изменение репертуара поведения крыс до и после введения эйфоригенных фракций представлено на рис. 3. Изученные нами другие фракции мозга мини-свиней (S-1 - S-20; S-22-23; DV-1 - DV-17; DV-19; DV-21 - 39) не вызывали достоверных изменений в продолжительности пребывания крыс в отсеках камеры LPlace Preference¦. Эти фракции мы рассматривали в качестве контроля по отношению к фракциям, обладающим выраженной положительной подкрепляющей активностью (S-21, DV-18, DV-20) (рис. 2).

В контрольных сериях экспериментов в установке LPlace Preference¦ исследовали влияние на поведение крыс инстилляции на конъюктиву глаз крыс воды 0,9% хлорида натрия, 10% и 15% растворов этанола, 300 нг/10 мкл ангиотензина-II и других физиологически активных веществ, приведенных в табл. 2. Каждое вещество исследовали на 18 крысах. В результате исследований, установлен своеобразный Lгомологический ряд¦ по подкрепляющей активности веществ (табл. 1). Из таблицы следует, что наибольшей положительной подкрепляющей активностью среди исследованных нами веществ обладает тиреотропин-осво-бождающий гормон (TRH), который превосходит по своей активности общеизвестный психостимулятор с высокой эйфоригенной активностью - кокаин.

Таблица 2

n = 258 - количество исследованных животных (по 6 для каждой фракции; по 30 - для фракций: К-2, К-13, К-17, К-20 и BEF (СИМК-1); * - P<0,05; ** - P<0,01 - в сравнении с фоном;

НПО - непредпочитаемый отсек камеры; ПО - предпочитаемый отсек камеры; С - стартовый отсек камеры; ОИП - ориентировочно-исследовательское поведение; КП - комфортное поведение;

ПП - пассивно-оборонительное поведение; ДП - другие формы поведения.3.2. Эффекты эйфоригенных фракций мозга быков

В 214 экспериментах исследовано 214 фракций мозга быков с молекулярной массой от 10 до 25 кД. Фракции имели маркировки K, порядковый номер. Последовательное выделение, очистка и тестирование фракций мозга быков показало, что фракции K-2, K-13, K-17, K-20 обладали наиболее выраженным положительным подкрепляющим действием (табл. 2). Инстилляция указанных фракций на конъюктиву крыс у 114 из 120 крыс (95,0%) вызывала изменение предпочтения места в камере и поведения (рис. 2). При этом достоверно (P<0,05) увеличивалось время пребывания животных в ранее непредпочитаемом отсеке камеры LPlace Prefe-rence¦. У животных после аппликации этих фракций доминировали комфортные формы поведения и полностью исчезало пассивно-оборонительное поведение. Фракции K-3, K-18, K-19 и некоторые другие проявили слабое по изменению временных показателей пребывания животных в отсеках камеры LPlace Preference¦ и по поведению подкрепляющее действие (Р<0,05). Большая же часть (89%) фракций была индифферентной. Инстилляция их на конъюктиву и внутрижелудочковые введения не вызывали значимых изменений в поведении и предпочтении крысами места в камере LPlace Preference¦.

В результате скрининговых исследований различных фракций мозга быков нами выделена белковая монофракция BEF (молекулярная масса 20 кД), обладающая наиболее выраженным, по сравнению с другими исследованными нами фракциями, подкрепляющим действием. Эта фракция была обозначена нами LСИМК-1¦. Фракция мозга быков, представляющая собой белок с молекулярной массой 20 кД, была подвергнута нами специальному анализу.

После инстилляции на конъюктиву у 60 крыс фракции СИМК-1 в дозе 20 пМ в 10 мкл апирогенного физраствора у всех без исключения исследованных животных отмечено изменение места предпочтения в отсеках камеры LPlace Preference¦ (табл. 2). Индивидуально в 5-100 раз и более - возрастало время пребывания животных в отсеке, где им ранее наносили электрокожные раздражения (рис. 2). У крыс после введения СИМК-1 отмечено изменение репертуара поведения. Начинали доминировать комфортные формы поведения (игра с хвостом, груминг, почесывание, сексуальные реакции и другое поведение). Полностью исчезало пассивно-оборонительное поведение (табл. 2, рис. 3). У крыс также исчезли отрицательные реакции на взятие в руки (Handling). Индивидуальный репертуар поведения крыс начинал восстанавливаться до исходного через 10-15 дней после однократной аппликации СИМК-1 на конъюктиву глаз. Вместе с тем, после введения фракций: К-2, К-13, К-17, К-20 и BEF (СИМК-1), - исходного восстановления поведения животных не происходило в течение всего периода наблюдения (до 30 суток) (рис. 3). В эти сроки у крыс также отсутствовали пассивно-оборонительные формы поведения.

У 120 крыс (по 24 животных в 5 группах) определяли дозозависимость эйфоригенной активности СИМК-1. Проведенные эксперименты показали, что у СИМК-1 отсутствует дозозависимость (рис. 4). Инстилляции на конъюктиву СИМК-1 в дозах от 10 до 2000 пМ, в равной степени вызывали у крыс изменение места предпочтения в камере LPlace Preference¦ (рис. 4), которые не имели достоверных различий (P>0,05) в зависимости от дозы.

На 30 крысах исследовали возможные механизмы реализации эйфоригенной активности СИМК-1 через опиатную систему мозга. Для этого животным предварительно (за 5 мин. до апликации СИМК-1 на конъюктиву глаз) в боковые желудочки мозга через канюлю вводили налоксон в дозе 1 мгк/200 г. Проведенные нами опыты показали, что предварительная блокада опиатных рецепторов налоксоном совершенно не изменяла подкрепляющее действие СИМК-1.

На 36 крысах был проведен сравнительный анализ эйфоригенной активности СИМК-1 при внутрижелудочковом введении и инстилляции на конъюктиву глаз. Опыты показали, что при инстилляции на конъюктиву глаз сопоставимых доз СИМК-1 эйфоригенные эффекты СИМК-1 были достоверно (Р<0,05) выше, чем при внутрижелудочковых инъекциях.

На 24 крысах, было установлено, что электрокожная стимуляция (сила тока индивидуальна для каждой крысы - от 0,3 до 1,5 мА) через электродный пол, после инстилляции на конъюктиву СИМК-1, у 9 из 24 крыс (37,5%) снижала среднее время пребывания в непредпочитаемом ранее отсеке на 8515 с. Вместе с тем, у 15 животных (62,5%) эти изменения носили слабовыраженный (2515 с), недостоверный характер (P<0,05). Таким образом, положительное подкрепляющее действие, вызванное аппликацией СИМК-1 на конъюктиву, проявлялось у животных и на фоне отрицательного эмоционального состояния, создаваемого ноцицептивной стимуляцией.

В серии экспериментов на 540 крысах проведен сравнительный анализ эйфоригенной активности СИМК-1, некоторых пептидов, белков, наркотиков и психостимуляторов (табл. 1). Каждое вещество подвергали тестированию на 18 крысах по их действию в тесте LPlace Preference¦. Проведенные исследования показали, что СИМК-1, эйфоригенная (под-крепляющая) активность которого нами условно была принята за 100%, проявляет наиболее выраженное положительное подкрепляющее действие среди исследованных веществ (табл. 1).

В то же время кокаин, выраженный психостимулятор с высоким эйфоригенным потенциалом, оказывает положительное подкрепляющее действие в два раза меньшее, чем СИМК-1. Трипептид тиреотропин-освобождающий гормон (TRH) по подкрепляющей активности занял промежуточное положение между СИМК-1 и кокаином.

Секвенирование эйфоригенного фактора, опре-деление N-концевого фрагмента последовательности позволило установить, что выделенное нами вещество является белком. Установлено несколько аминокислотных остатков X-X-Gly-Phe-Leu-?

Таким образом, в результате проведенного нами большого скриннингового исследования, установлено, что в мозгу мини-свиней при приеме этанола в процессе удовлетворения алкогольной мотивации, а также в нативном мозгу быков содержится эндогенный фактор белковой природы - СИМК-1, обладающий выраженным подкрепляющим свойством. Выделенный нами фактор оказался крупномолекулярным белком (молекулярная масса около 20 кД).

При аппликации на слизистую глаз СИМК-1 вызывает существенные изменения в поведении крыс в камере LPlace Preference¦. После аппликации СИМК-1 крысы начинают предпочитать посещать отсек камеры, где им апплицировали СИМК-1 и который ранее являлся непредпочитаемым, даже если в нем животным наносили электрокожное раздражение. Введение СИМК-1 изменяет репертуар поведения крыс. В общей структуре поведения начинают преобладать комфортные реакции: груминг, игровое поведение, почесывания, сексуальные реакции. При этом из поведенческого репертуара элиминируется пассивно-оборонительное поведение. Все это указывает на эйфоригенные свойства СИМК-1. Известно, что белок - предшественник TRH - имеет молекулярную массу около 20 кД, а сам TRH, как показали наши эксперименты, обладает высокой положительной подкрепляющей (эйфоригенной) активностью. Поэтому можно думать, что СИМК-1 может иметь отношение к белкам-предшествен-никам TRH. Вместе с тем, тонкие механизмы реализации эйфоригенного действия как СИМК-1, так и TRH, кокаина и других эйфоригенов остаются невыясненными и служат предметом для перспективных исследований. Можно думать, что именно СИМК-1 определяет состояние эйфории как при приеме этанола, так и в процессе удовлетворения других биологических потребностей организма.

1. Анохин П.К., Судаков К.В. Нейрофизиологическая теория голода, аппетита и насыщения // Усп. физиол. наук.- 1971.- Т.2, ¦3.- С.272-282.
2. Анохин П.К. Системный анализ интегративной деятельности нейрона // Усп. физиол. наук.- 1974.- Т.5, ¦2.- С.5-92.
3. Мещеряков А.Ф., Душкин В.А., Мальцев К.В., Емельянова Т.М. Поиск эндогенных нейропептидов с эйфоригенными свойствами. В кн.: Фундаментальные достижения нейрохимии медицине // Мат. Х всес. конф.- Горький, 1987.
4. Мещеряков А.Ф., Мальцев К.В. Выделение эндогенных белково-пептидных факторов с эйфоригенными свойствами. В кн.: Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы.- М., 1988.- С.84-85.
5. Садовник М.Н., Сатановская В.И. Изменение потребления этанола у мышей при введении экстрактов мозга крыс // Вестник АН БССР.- 1978.- ¦1.- С.110-111.
6. Судаков К.В., Мещеряков А.Ф., Мальцев К.В., Душкин В.А., Беляев С.В. Способ выделения и определения физиологической активности пептидов головного мозга млекопитающих // Заявка на изобретение ¦ 4328448 \ 14 код 167963, 1987.
7. Судаков К.В. Квантование жизнедеятельности // Усп. совр. биол.- 1992.- Т.112.-В.4.
8. Burglass M.E., Shaffer H. Thinking hidh: a metaphor from the past, in the present and perhops, for the future // J.Psychoact. Drugs.- 1984.- 16, ¦2.- P.201-204.
9. Katz R.J., Cormezano G. A rapid in expensive technique for assessi the reinforing effeebi of opiate drugs // Pharm. Biochem. Behav.- 1979.- 11.- P.231-233.
10. Lithin G.R., Tabakoff B. Activation of adenylate cyclase by alcohols requires the nucleotide-binding protein // J.Pharmacol. and Exp. Ther.- 1984.- 228, ¦3.- P.578-589.
11. Mucha R.F. et al. Drug reinforcement studied by use of place coudoterenty in rat // Brain Res.- 1982,- 243.- P.91-105.
12. Shorr I., Foley K., Spector S. Presence of a non-peptide morphine-like compound in human cerebrospinal fluid // Life Sci.- 1978,- 23, ¦20.- P.2057-2062.
13. Stein Z., Belluzzi D. Brain endorphins and the sense of well-being: a psychobiological hypothesis- In: The endorphins / Ed. by E.Costa, M.Trabucchi, New Yprk, Raven Press, 1978.- P.299-311.
14. Sun G., Sun A.G. Ethanol and membrane lipids // Alcoholism.- 1985,- 9, ¦2.- P.164-180.
15. Tarasci T.F., Rubin E. Effects of ethanol on the chemical and structural properties of biologic membranes // Lab. Invest.- 1985,- 52, ¦2.- P.120-131.

It has been revealed that in a mini-pig brain during satisfaction of alcoholic motivation, and also in native brain of bulls the endogenic factor of a proteine nature - SIMK-1 is contained, which possesses expressed positive reinforsing (euphorigenic) properties. Isolated by us for the first time and unknown earlier the factor appeared to be macromolecular protein (molecular mass about 20 kD). At the same time, subtle mechanisms of implementation of euphorigenic action of SIMK-1, TRH, cocaine and other euphorigenics remain obscure and are the subject for perspective researches. The obtained data allow to assume it is SIMK-1 that determines an euphoria state when uptaking etanol, or during satisfaction of other biological necessities of an organism.